含氟化合物是医药、农业和材料领域的关键结构单元，然而在温和条件下实现偕二氟基团的高选择性、可持续引入仍是一大挑战。近年来，光酶催化融合了光催化和生物催化的优势，为不对称合成提供了强有力的平台，其中黄素单核苷酸（FMN）依赖型“烯”还原酶（EREDs）备受关注。酶在长期的自然进化中形成了固有的底物特异性，直接用于非天然转化时效率较低。传统的定向进化方法通常需筛选数千至上万个突变体，耗时费力；而基于蛋白质语言模型（PLMs）的“零样本”预测在面对非天然自由基反应时，往往因缺乏特定的训练数据，难以准确建立序列与催化活性/选择性之间的映射关系。

针对上述挑战，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所客座研究员/南京师范大学教授周佳海与团队副研究员古阳等提出了一种将活性口袋理性设计与机器学习模型相结合的小样本、加速进化策略，该成果以“Machine-Learning-Enabled Rapid Evolution of Photoenzymes for the Asymmetric Synthesis of gem-Difluorophosphonates”为题，作为VIP论文发表于《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）。研究团队通过结构导向的热点识别与主动学习，仅在三轮进化中筛选了40个突变体，便成功获得了兼具高活性和高对映选择性的光酶突变株，整体工作量较穷举筛选减少了65%。该工作为非天然光酶催化体系的高效开发提供了一种“轻量级”的机器学习框架。

文章上线截图

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.1402106

破局：光酶催化“驯服”高活性烷基自由基反应

烷基自由基因活性高、寿命短，如何“驾驭”其可控、定向、非对称合成，一直是有机催化领域的难题。研究团队以溴二氟甲基膦酸二乙酯为自由基前体、α-甲基苯乙烯为自由基受体，首先开展了反应体系的构建。在初步筛选中，来自Gluconobacter的“烯”还原酶（GluER）突变体T36A展现出独特潜力——尽管初始产率仅为5%，却表现出极高的对映选择性（94:6 e.r.）。为进一步提升反应效率，团队系统优化了反应参数，成功将野生型酶的产率由5% 提升至58%，且选择性保持优异。控制实验表明：酶、NADPH再生系统、光照和厌氧环境对于反应的发生缺一不可。

图1. 反应设计及初始酶库筛选

创新：从传统定向进化到AI指导设计

为进一步突破产率和选择性瓶颈，研究团队开发了AI指导的智能文库设计方法。他们通过AutoDock Vina构建了底物、辅因子与酶的四元复合物结构，将距离底物和辅因子5Å范围内的38个氨基酸残基作为潜在突变位点。随后，采用聚焦理性迭代位点特异性诱变（FRISM）策略，将这些位点分别突变为空间位阻不同的三种氨基酸（A、L、F），构建了一个包含114个候选突变体的精简“智能文库”。利用蛋白质大语言模型ESM2对序列进行特征嵌入，并改进了EVOLVEpro模型，通过对产率和对映选择性进行加权复合评分，协同指导主动学习。

图2. AI指导的FRISM策略加速光酶定向进化

高维的ESM2嵌入特征需要匹配合适的顶层模型，才能将从进化信息中提取的适应性景观（fitness landscape）微调至特定的活性/选择性景观（activity/selectivity landscape）。研究团队利用基线数据集对比了9种机器学习算法，确定随机森林（Random Forest）为最稳健的顶端预测器。在随后的3轮迭代进化中，模型仅推荐并测试了40个突变体，便锁定了4个关键单突变。通过进一步的双位点组合突变，成功挖掘出两个性能卓越的组合突变体：ER1实现了几乎完全转化的产率（95% yield, 95:5 e.r.）；ER2实现了最优的对映选择性（75% yield, 97:3 e.r.）。

图3. 顶层模型性能对比与AI指导的定向进化轨迹

应用：含氟磷酸酯类化合物的高效、高选择性合成

获得了最优反应条件及突变体ER1和ER2后，研究团队对其底物适用范围进行了广泛拓展。结果表明：

50. 该光酶体系对各类带有给电子基或吸电子基的间位、对位取代苯乙烯衍生物表现出良好的耐受性。
50. 杂环底物以及具有大位阻的复杂底物均能以最高 >99% 的产率和98:2 e.r. 高效转化为相应的含氟目标产物。
50. 分子对接表明：ER1的高产率源于更高效的底物装载和更便利的氢原子转移过程；而ER2的高选择性则受活性口袋内F269残基明显的空间位阻效应驱动。

此外，在制备级的1 mmol放大实验中，ER1依然能以88%的分离收率催化得到目标产物，且该产物可高效水解为生物活性分子设计中常见的膦酸结构单元，彰显了极高的合成应用价值。

图4. 最优突变体的底物拓展、制备级合成及生物活性分子衍生化

机理：光酶催化自由基发生、加成与发散性氢原子转移

为了阐明光酶催化的深层机理，研究团队开展了系列机制探究。研究表明，该循环起始于GDH介导的氢负离子转移，将氧化态黄素FMN_ox还原为氢醌态FMN_hq；伴随着自由基前体扩散进入酶活性口袋空腔，可见光激发的FMN_hq^*单电子还原自由基前体并促使溴负离子离去产生二氟甲基自由基；高活性的二氟甲基自由基会快速加成到附近的不饱和烯烃上，产生较稳定的苄基自由基中间体；该苄基自由基中间体会从酶口袋辅因子或活性氨基酸中攫取一个氢原子以得到最终特定构型的产物。

一系列机理实验揭示了该过程的关键细节：

1. 无EDA复合物形成：紫外-可见光光谱（UV-Vis）证实反应体系中不存在底物与酶/辅因子之间的电荷转移复合物，表明自由基前体的还原直接由蛋白质骨架内光激发的黄素氢醌态FMN_hq^*通过单电子转移驱动。
2. 自由基中间体验证：自由基钟实验使用α-环丙基苯乙烯作为探针，成功捕捉到开环产物，证实了反应中瞬态苄基自由基中间体的存在。
3. 氢原子转移路径：同位素标记实验揭示了令人惊奇的现象——在ER1中，苄基自由基主要通过黄素半醌态FMN_sq的N5H氢原子转移终止；而在ER2中，底物结合构象改变使得FMN_sq氢原子转移在空间上不可行，苄基自由基转而从活性口袋内的关键残基Y343上攫取氢原子。

有趣的是，当在ER2中引入Y343F突变关闭自由基淬灭路径后，反应的产率和选择性大幅降低，并伴随大量去饱和烯烃副产物的生成。这一意外的发现表明FMN_sq具有将自由基中间体氧化为碳正离子的潜力，为未来开发新型自由基介导的烯烃构建反应提供了全新思路。

图5. 光酶催化循环与自由基淬灭机制探究